Paracelsus Medical University – Lesioni del midollo spinale e centro di rigenerazione tessutale di Salisburgo, 5020 Salisburgo, Austria 

Le risposte globali del tendine 3D Il-1β-Primed si trasformano in trattamento con campi elettromagnetici pulsati.

Renate Gehwolf, Bettina Schwemberger, Malik Jessen, Stefanie Korntner, Andrea Wagner, Christine Lehner, Nadja Weissenbacher, Herbert Tempfer and Andreas Traweger.

1 Istituto di tendine e rigenerazione ossea, Paracelsus Medical University – Lesioni del midollo spinale e centro di rigenerazione tessutale di Salisburgo, 5020 Salisburgo, Austria

2 Cluster austriaco per rigenerazione tessutale, 1200 Vienna, Austria

3 Istituto di medicina trasfusionale e immunologia, Facoltà di medicina Mannheim, Croce rossa tedesca Donatore di sangue Baden-Württemberg-Hessen gGmbH, Università di Heidelberg, 68167 Mannheim, Germania

4 Ingegneria rigenerativa, modulare e dello sviluppo Laboratorio (REMODEL); Science Foundation Ireland Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM) Università Nazionale d’Irlanda Galway; H91 W2TY Galway, Irlanda * Corrispondenza: andreas.traweger@pmu.ac.at; Tel .: + 43-662-2420-80860 † Questi autori hanno contribuito ugualmente a questo lavoro. Ricevuto: 28 marzo 2019 / Accettato: 27 aprile 2019 / Pubblicato: 30 aprile 2019

Abstract:

la tendinopatia è accompagnata da una catena di eventi infiammatori che promuovono la degenerazione del tendine. Tra le varie citochine, l’interleuchina-1β svolge un ruolo centrale nel guidare i processi catabolici, portando infine all’attivazione delle metalloproteinasi della matrice e ad una diminuita sintesi del collagene, che promuovono entrambi la degradazione della matrice extracellulare del tendine. La terapia a campi elettromagnetici pulsati (PEMF) viene spesso utilizzata per la gestione del dolore, l’osteoartrosi e la guarigione ritardata della ferita.

È stato dimostrato che il trattamento PEMF in vitro delle cellule derivate dai tendini modula le citochine pro-infiammatorie, limitando potenzialmente i loro effetti catabolici. Tuttavia, la nostra comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti rimane limitata.

Abbiamo quindi studiato le risposte a livello di trascrittoma di costrutti simili a tendine 3D di derivazione di Achille basati su cellule di tendine di Achille di ratto primerizzato al trattamento PEMF ad alta energia. L’analisi RNASeq e l’assegnazione di ontologia genetica hanno rivelato vari processi biologici che sono stati influenzati dalla PEMF, tra cui il rimodellamento della matrice extracellulare e la regolazione negativa dell’apoptosi. Inoltre, mostriamo che i membri della famiglia di citoprotezione Il-6 / gp130 e il recettore di illecito Il-1β Il1r2 sono regolati positivamente sull’esposizione a PEMF. In conclusione, i nostri risultati forniscono una visione meccanicistica fondamentale della modalità di azione cellulare e molecolare della PEMF sulle cellule dei tendini e possono aiutare a ottimizzare i protocolli di trattamento per la terapia non invasiva delle tendinopatie.

Parole chiave: tendine; tendinopatia; campo elettromagnetico pulsato (PEMF); stimolazione magnetica periferica ripetitiva (rPMS); Il-1β; ricevitore di decoy Il1r2; RNA-Seq; apoptosi

1. Introduzione Lesioni da uso eccessivo dei tendini e tendinopatie rappresentano condizioni debilitanti che colpiscono sia la popolazione attiva che gli atleti dilettanti e rappresentano una delle condizioni più frequenti muscolo-scheletriche per le quali i pazienti richiedono un parere medico

[1]. Nonostante molti progressi della medicina, le lesioni al tendine acuto e le tendinopatie croniche rimangono clinicamente impegnative

[2]. La natura ipocellulare e ipovascolare in combinazione con l’intricata architettura della matrice extracellulare (ECM) ostacola in modo significativo la guarigione dei tessuti, con conseguente tessuto cicatriziale biomeccanicamente inferiore soggetto a ri-rottura e spesso favorendo lo sviluppo e la progressione dei processi degenerativi

[3]. Generalmente, i risultati dei trattamenti attuali, inclusi fisioterapia, ultrasuoni, terapia con onde d’urto extracorporee, farmaci antinfiammatori non steroidei e, infine, la chirurgia sono spesso insoddisfacenti e i tempi di riabilitazione possono essere lunghi

[4]. Lo sviluppo di strategie di trattamento efficaci è attualmente ostacolato dalla nostra scarsa comprensione degli eventi molecolari e cellulari alla base della tendinopatia. In passato la tendinopatia è stata principalmente considerata un processo non infiammatorio e degenerativo. In effetti, è in corso un dibattito sull’eventualità che l’infiammazione sia un fattore chiave della tendinopatia. Tuttavia, studi recenti dimostrano in modo convincente che una cascata di eventi infiammatori, come l’infiltrazione di linfociti e macrofagi, l’attivazione della matrice metalloproteasi (MMP) e la secrezione di mediatori dell’infiammazione, incluse varie citochine, prostaglandine e ossido nitrico [5,6,7] sono centrale per l’eziologia delle tendinopatie. Sebbene le citochine chiave nella malattia del tendine non siano state ancora del tutto definite, i familiari della famiglia dell’interleuchina -1 (Il-1), in particolare Il-1β, possono innescare la degradazione catabolica della ECM tramite l’attivazione di MMPs, contribuendo così a la progressione della tendinopatia

[8,9]. Pertanto, mirare alla cascata infiammatoria per spostare una risposta infiammatoria “degenerativa” a una risposta “rigenerativa” e ridurre il rimodellamento aberrante della ECM sembra promettente per gestire le tendinopatie. Diversi regimi di trattamento conservativo vengono applicati per ridurre il dolore e migliorare la funzione del tendine, comprese varie modalità di elettroterapia. Una terapia emergente per il trattamento dell’infiammazione sia acuta che cronica è l’applicazione di campi elettromagnetici pulsati a bassa e alta energia (PEMF) [10,11], quest’ultima chiamata anche stimolazione magnetica periferica ripetitiva (rPMS). Nel 1979, la Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha approvato la PEMF come sicura ed efficace per il trattamento di ritardati e non ioni nell’osso

[12]. Da allora, PEMF è stato proposto per essere efficace nel trattamento di una varietà di patologie, compresa la guarigione ritardata della ferita [13], il dolore postoperatorio cronico [14] e l’osteoartrite [15,16].

In vitro, la PEMF ha dimostrato di essere potente nel limitare gli effetti catabolici delle citochine proinfiammatorie sulla cartilagine ialina [17,18], suggerendo che la PEMF è in grado di limitare l’infiammazione e promuovere la riparazione dei tessuti molli. Inoltre, PEMF a bassa intensità, ha dimostrato di inibire il rilascio di PGE2 indotto da TNF-α o LPS nei fibroblasti sinoviali bovini, molto probabilmente mediante la modulazione delle vie anti-infiammatorie mediate da adenosina [19]. Più recentemente, è stata studiata la possibilità di applicare PEMF per la gestione dei disturbi del tendine. Il trattamento PEMF dei tenociti umani in colture cellulari in vitro 2D ha provocato un alterato profilo di citochine e TGFβ e una maggiore espressione del collagene di tipo I [20].

Studi preclinici in vivo indicano anche che il trattamento con un campo elettromagnetico pulsato a bassa frequenza può migliorare la riparazione del tendine di Achille del ratto [21,22]. Infine, in uno studio clinico controllato e randomizzato, Osti et al. hanno dimostrato che il trattamento con PEMF riduce il dolore postoperatorio, l’uso di analgesici e la rigidità dopo la riparazione della cuffia dei rotatori. È interessante notare che gli autori non hanno osservato alcun miglioramento funzionale in un follow-up di 2 anni [23]. Complessivamente, la nostra comprensione delle risposte biologiche dei tenociti a un segnale fisico da uno stimolo elettromagnetico rimane molto limitata. Pertanto, l’obiettivo di questo studio era di indagare le risposte a livello di trascrittoma di costrutti simili a tendini 3D coltivate in condizioni pro-infiammatorie al trattamento PEMF / rPMS ad alta energia. I risultati di questo studio forniscono approfondimenti meccanicistici sul cellulare e molecolare ramificazioni del trattamento PEMF e sosterranno lo sviluppo di protocolli ottimizzati per il trattamento non invasivo delle tendinopatie.

2. Materiali e metodi

2.1. Animali e coltura cellulare Sono stati usati ratti Fischer344 di tre mesi per tutti gli esperimenti. I ratti dei donatori di tessuti sono stati alloggiati e sottoposti ad eutanasia conformemente alle rispettive leggi austriache sul benessere degli animali e sulla sperimentazione. Staminali tendinee e cellule progenitrici (successivamente denominate TDSPC) sono state isolate e coltivate come descritto in precedenza [24]. In breve, i tendini di Achille sono stati sezionati in condizioni sterili e lavati con PBS sterile senza Ca2 + e Mg2 + (successivamente denominato PBS) e α-MEM (mezzo essenziale minimo con GlutaMAXTM da 2 mM). Il tessuto del tendine è stato quindi tagliato in piccoli pezzi e incubato in 3 mg / ml di collagenasi di tipo II (Gibco Lifetechnologies, Vienna, Austria) in α-MEM con siero bovino fetale al 10% (FBS), Glutamax 2 mM, 100 unità mL-1penicillina e 0,1 mg di mL-1 streptomicina (P / S, SigmaAldrich, Vienna, Austria), O / N a 37 ° C, 5% di CO2 e 90% di umidità. Il giorno seguente, le cellule sono state lavate in α-MEM con FBS al 10%, Glutamax 2 mM e P / S e coltivate fino a quasi una confluenza. Il numero di cellule e la vitalità cellulare sono stati determinati con un sistema di conteggio delle cellule di LunaTM (Logos Biosystems, Annandale, VA, USA) in base alle istruzioni del produttore. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con cellule al passaggio

3. 2.2. Formazione di costrutti simili ai tendini in vitro

3. I costrutti del tendine D sono stati assemblati come descritto in riferimento [25]. In breve, ciascuna capsula di Petri è stata rivestita con 15 mL di elastomero siliconico Sylgard 184 (Dow-Chemicals, Vienna, Austria) e lasciato polimerizzare a 48 ° C O / N. Successivamente, suture di seta lunghe 2 × 0,8 mm sono state appuntate con perni di insetti minuti (0,1 mm di diametro, Science Service, Monaco, Germania) sullo strato di silicone con una distanza di 1 cm tra le due suture (8 unità per piatto di coltura). Le piastre sono state quindi sterilizzate con etanolo al 70% e esposte a irradiazione UV per 30 minuti ciascuna. Prima dell’uso le piastre sono state lavate con PBS sterile. TDSPCs (passaggio 3) sono stati risospesi in 2 mg / mL di collagene puro di ghiaccio freddo di tipo 1 (Sigma-Aldrich, Vienna, Austria) in α-MEM senza siero integrato con P / S ad un numero di cellule finale di 2,5 × 105 mL -1. Sospensione cellulare (130 μL per ogni struttura) è stata quindi immediatamente pipettata tra le 2 suture di seta. Il collagene è stato quindi lasciato polimerizzare per 1 ora a 37 ° C in un incubatore di colture cellulari. Infine, sono stati aggiunti 15 mL di terreno di coltura completo (α-MEM integrato con FBS al 10%, GlutaMax 2 mM, P / S, 10 μg / mL di aprotinina, acido ascorbico 0,2 mM e L-prolina 0,05 mM) e il mezzo era scambiati ogni altro giorno. Dopo 7 giorni di contrazione, i costrutti simili ai tendini sono stati utilizzati per il trattamento PEMF. 2.3. Stimolazione Pro-Infiammatoria / Condizionamento di costrutti simili a tendini La stimolazione pro-infiammatoria di costrutti tendinei è stata effettuata dopo 7 giorni di contrazione con 10 ng / ml di ratto ricombinante interleuchina-1β (rIl-1β, PeproTech, Vienna, Austria) in mezzo di coltura per 24 ore. Un’ora prima del trattamento con PEMF / esposizione con terreno contenente rIl-1β è stato sostituito con terreno di coltura completo senza rIl-1β. I surnatanti sono stati raccolti prima del trattamento con rIl-1β (supernatante 1), dopo 24 ore di incubazione con rIl-1β (supernatante 2) e dopo il protocollo di esposizione PEMF completato (2 cicli di 60 min di esposizione PEMF e 90 minuti di riposo ciascuno; surnatante 3) e conservato a -80 ° C fino al successivo utilizzo.

2.4. Trattamento PEMF Il trattamento PEMF / rPMS ad alta energia è stato eseguito con un dispositivo promosso © OMNITRON (Healthfactories GmbH, Surheim, Germania). La massima densità del flusso magnetico e la frequenza fondamentale del segnale PEMF erano 82 mT e 125 kHz, rispettivamente. La frequenza dell’impulso era 2 Hz con una durata di burst di 80 μsec. I costrutti del tendine 3D sono stati trattati come segue: 2 cicli di trattamento a 82 mT per 60 minuti ciascuno seguiti per 90 minuti di riposo sono stati eseguiti in un incubatore di colture cellulari a 37 ° C, 5% di CO2 e 90% di umidità. I costrutti sono stati raccolti 90 minuti dopo la seconda esposizione.

2.5. Vitalità cellulare, attività metabolica e test di citotossicità La vitalità cellulare è stata analizzata dal kit di imaging LIVE / DEAD (Invitrogen, Vienna, Austria) in base alle istruzioni del produttore su un microscopio a scansione laser LSM700 (Carl Zeiss, Jena, Germania). L’attività metabolica cellulare e la citotossicità dopo il trattamento con PEMF sono state determinate utilizzando il test CellTiter 96® AQueous One Solution Proliferation Cell (MTS) e misurando il contenuto totale di ATP utilizzando il test CellTiter Glo® 2.0 (sia Promega, Vienna, Austria) che segue il produttore Istruzioni.

2.6. Isolamento, quantificazione e convalida dell’RNA I costrutti simili a tendini sono stati lavati in PBS sterile e poi omogeneizzati su TRIZol (FisherScientific, Vienna, Austria) su ghiaccio utilizzando un Ultra-Turrax (IKA, Staufen, Germania). L’RNA totale è stato preparato secondo le istruzioni del produttore con piccole modifiche. Sono stati eseguiti due ulteriori passaggi di estrazione di cloroformio. Successivamente, l’RNA totale è stato precipitato per 30 minuti a -20 ° C con un uguale volume di isopropanolo ghiacciato e con l’aggiunta di 1 μg di co-precipitatore GlycoBlue (Ambion, Lifetechnologies, Vienna, Austria), seguito da centrifugazione per 30 minuti a 13.000 giri al minuto a 4 ° C. I pellet di RNA sono stati risospesi in acqua priva di RNasi con 20 unità di inibitore SuperaseTMRNase (Ambion, Lifetechnologies, Vienna, Austria) e conservati a -80 ° C fino a nuovo utilizzo. La resa di RNA è stata quantificata utilizzando un Nanodrop 2000C (ThermoFisher Scientific, Vienna, Austria) e l’integrità dell’RNA è stata verificata utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzata Experion (Biorad, Monaco, Germania). Un requisito minimo dell’indicatore di qualità dell’RNA (RQI)> 9.0 è stato scelto per il sequenziamento dell’RNA e RT-qPCR.

2.7. La preparazione della libreria RNASeq e analisi dei dati e il sequenziamento dell’RNA (sequenziamento dell’mRNA, letture single-end 50bp, 30M per campione) sono stati eseguiti presso Exiqon (Qiagen, Hilden, Germania). L’analisi è stata eseguita su costrutti tendine stabiliti con cellule tendine isolate da 3 singoli ratti. L’espressione di espressione differenziale e l’ontologia del gene (GO) è stata eseguita utilizzando FunRich (http://www.funrich.org/; v 3.1.3; database GO Norvegia rat, ID: 10116). I geni con un p-value aggiustato inferiore a 0.05 sono stati utilizzati per ulteriori analisi e i geni candidati sono stati verificati mediante RT-PCR quantitativa.

2.8. Trascrizione inversa ed analisi dell’espressione genica La sintesi del cDNA del primo filamento è stata eseguita con iScript SupermixTM (Biorad, Monaco, Germania) in base alle raccomandazioni del produttore. Per PCR quantitativa 5 ng / po cDNA è stato successivamente analizzato utilizzando TaqMan Assays (sia da Integrated DNA Technologies o Applied Biosystems, vedere la tabella supplementare S4) e Luna® Universal Probe qPCR Master Mix (New England Biolabs, Francoforte sul Meno, Germania). Le condizioni di amplificazione erano le seguenti: denaturazione iniziale per 60 s a 95 ° C, seguita da 40 cicli di 15 s a 95 ° C e 30 s a 60 ° C. Tutti i campioni sono stati analizzati in duplicati e i valori CQ sono stati analizzati utilizzando qBaseplus v2.4 (Biogazelle) e le quantità relative normalizzate sono state calcolate normalizzando i dati all’espressione di geni di controllo endogeno precedentemente validati come descritto in riferimento [26].

2.9. Protein Lysates, SDS-PAGE e Western Blot I costrutti simili a tendini sono stati lavati in PBS, lisati e omogeneizzati in tampone RIPA ghiacciato (Sigma-Aldrich, Vienna, Austria) integrato con cocktail inibitore della proteasi (Sigma-Aldrich, Vienna, Austria; concentrazioni finali di AEBSF (4- (2Aminoethyl) benzensulfonylfluorid) a 1,04 mM, Aprotinina a 0,8 μM, Bestatina a 40 μM, Leupeptina a 20 μM, E-64 a 14 μM e Pepstatin A a 15 μM) e 1 × inibitore della fosfatasi cocktail 3 (Sigma Aldrich, Vienna, Austria). Da 10 a 20 μg di proteine ​​totali sono stati separati su gel di poliacrilammide TGX Stain-freeTM al 10-12% (Biorad, Monaco, Germania) in tampone Laemmli [27]. Le proteine ​​sono state poi trasferite a un fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana (Biorad, Monaco di Baviera, Germania) e successivamente le membrane sono state bloccate per 2 ore in BSA al 5% in soluzione salina tamponata tris con 0,05% di Tween 20 (successivamente denominato TBST). Le membrane sono state sondate con O / N a 4 ° C in anticorpi primari (topo ani-ERK1 / 2; 1: 1000; R & D Systems e coniglio antiphospho-p44 / 42 ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204), 1: 2000; Cell Signaling Technologies) in una soluzione di blocco. Dopo il lavaggio delle membrane in TBST, le membrane sono state sondate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi appropriati in TBST per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio finale, le macchine sono state sviluppate utilizzando un sistema di imaging Chemidoc MP e il substrato Clarity Western ECL (Biorad, Monaco, Germania).

2.10. Cryo-Embedding e Sectioning I costrutti simili a tendine sono stati lavati in PBS e fissati in paraformaldeide al 4% per 1 ora a temperatura ambiente, lavati due volte per 15 minuti in PBS, incubati in serie O / N in saccarosio al 15% (p / v) in PBS, O / N in saccarosio al 30% (p / v) in PBS e O / N in miscela 1: 1 di saccarosio 30% e composto di sezione congelata Surgipath® FSC22® (Leica Microsystems, Vienna, Austria). Infine, i costrutti sono stati crioconservati in composto di sezione FSC22® congelato Surgipath® su ghiaccio secco e conservati a -80 ° C fino al successivo utilizzo. Il sezionamento (sezioni da 10 e 20 μm) è stato eseguito con un microtomo Criostato CM1950 (Leica Microsystems, Vienna, Austria).

2.11. TUNEL Staining and Caspase3 / 7 Assay Activity La determinazione dell’apoptosi è stata eseguita colorando le criosezioni con il kit di rilevamento della morte cellulare in situ, Fluoresceina (Roche, Vienna, Austria) in base alle raccomandazioni del produttore. La quantificazione della colorazione TUNEL è stata eseguita utilizzando il software ImageJ software ImageJ v. 150a [28]. L’attività di Caspase3 / 7 è stata misurata utilizzando lisati proteici di costrutti tendinei e il saggio Caspase-Glo® 3/7 (Promega, Vienna, Austria).

2.12. Per la determinazione dell’orientamento delle fibre di collagene di tipo I e della densità di impaccamento è stata utilizzata la quantificazione del rapporto di aspetto nucleare, l’orientamento delle cellule e la microscopia di densità del collagene. L’intensità della birifrangenza è stata misurata mediante quantificazione dell’intensità media dei pixel utilizzando il software ImageJ v. 150a [28]. Per la microscopia di polarizzazione, le sezioni non colorate dei costrutti tendinei sono state riprese utilizzando un obiettivo 10 × o 16 × dotato di un filtro di polarizzazione montato su un microscopio Axioplan (Carl Zeiss, Jena, Germania). L’orientamento delle cellule è stato determinato mediante il calcolo del rapporto di aspetto nucleare [29] e la deviazione angolare dell’orientamento delle fibre di tensione su sezioni colorate con rodaminefalosidina.

2.13. Interleukin-6 ELISA e quantificazione della produzione di NO La secrezione dell’interleuchina-6 (Il-6) dei costrutti tendinei è stata determinata in surnatanti di colture cellulari raccolti come descritto sopra utilizzando un kit ELISA Il-6 di ratto (RayBiotech, Norcross, GA, USA) secondo le istruzioni del produttore. La rilevazione dei metaboliti di NO in supernatanti di colture cellulari è stata eseguita con un kit di dosaggio nitrito / nitrato colorimetrico (Sigma-Aldrich, Vienna, Austria) in base alle istruzioni del produttore. Per la determinazione della concentrazione di nitrato, 5 μL di nitrato riduttasi e 5 μL di soluzione di co-fattore enzimatico sono stati aggiunti a 40 μL di campione in una piastra a 96 pozzetti. Dopo un’incubazione di 2 ore a 25 ° C con agitazione, 50 μL di soluzione Griess A sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati per 15 minuti a 25 ° C su un agitatore. Infine, sono stati aggiunti 50 μL di soluzione Griess B e la piastra è stata incubata su uno shaker per 10 minuti a 25 ° C, prima dell’assorbimento a 540 nm mas misurata in un lettore di micropiastre Tecan SPARK (Tecan, Groedig, Austria). La concentrazione di nitrito / nitrato è stata calcolata con una curva standard di nitrito + nitrato sottraendo il valore del bianco medio da tutti i pozzetti. Per la concentrazione totale di NO nei campioni, sono state riassunte le concentrazioni di NO3- + NO2-.

2.14. MMP2 e MMP9 in Gel Zymography Per la determinazione dell’attività enzimatica di MMP2 e MMP9, i supernatanti di colture cellulari di costrutti 3D tendinei sono stati analizzati mediante gel in gel zimografia. Pertanto, il 10% di gel SDS-poliacrilammide è stato copolimerizzato con gelatina 1 mg / ml.

Il supernatanti di colture cellulari (30 μl ciascuno) sono stati miscelati con tampone di campionamento per ssione di tris-glicina Laemmli e incubati per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi sono stati caricati i campioni e il gel è stato eseguito con tampone da corsa tris-glicina SDS-PAGE. Per il gel di rivelazione dell’attività enzimatica sono stati incubati in tampone renaturing 1 × (2,5% Triton X-100 (v / v) in acqua) per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione delicata per rimuovere SDS e consentire alle MMP di renatura, seguite da 30 minuti in 1 Buffer di sviluppo × zimogramma (50 mM Tris-HCl pH 7,45, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl2 e 0,02% (v / v) Brij 35). Il tampone di sviluppo è stato sostituito una volta e i gel sono stati incubati durante la notte a 37 ° C con agitazione delicata per la massima sensibilità. Il giorno successivo, i gel sono stati colorati per 30 min con 0,5% (p / v) di Coomassie Brilliant Blue in 40% (v / v) di etanolo e 10% (v / v) di acido acetico in acqua e stabilizzati con una miscela di 40% (v / v) di etanolo e 10% (v / v) di acido acetico in acqua fino a quando le bande chiare diventano visibili. Quelle bande chiare rappresentavano le aree in cui le MMP avevano digerito il substrato di gelatina. Per la quantificazione i gel sono stati fotografati con il dispositivo ChemiDoc MP (BioRad, Monaco, Germania) e le intensità della banda sono state misurate usando lo strumento Volume del software ImageLab (BioRad, Monaco, Germania).

2.15. Analisi statistica Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software Graph Pad Prism (versione 5.04). I dati densitometrici sono presentati come medie con deviazioni standard. L’analisi della variazione a senso unico (ANOVA) che applicava il test KruskalWallis non parametrico è stata utilizzata per verificare le differenze tra i gruppi. L’analisi a coppie dei dati qRT-PCR è stata eseguita utilizzando il test di Mann-Whitney. Un valore p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

3. Risultati

3.1. Progettazione sperimentale e analisi dei dati RNASeq Come illustrato nel flusso di lavoro di progettazione sperimentale (Figura 1A), campioni di RNA totale sono stati raccolti da colture di tenociti incapsulate in coltura in vitro generate da TDSPC isolate da tendini di Achille di ratto. In totale, sono stati ottenuti 3 replicati biologici (costrutti tendine di 3 singoli animali) e 8 costrutti per animale e il trattamento sono stati assemblati in un singolo piatto (Figura 1B). I costrutti sono stati stimolati con Il-1β per 12 ore o non trattati e successivamente esposti a PEMF / rPMS come descritto nella sezione dei metodi (Figura 1C). In totale 12 librerie RNA-seq sono state preparate e sequenziate a profondità da 24,23 a 31,96 milioni di letture per campione. In tutte le librerie, le velocità di allineamento della lettura single-end al genoma del ratto Rnor_5.0 erano comprese tra 84,05 e 92,98%. Per l’analisi differenziale sono stati effettuati due confronti a coppie utilizzando Cuffdiff2: (1) controllo non trattato vs stimolazione Il-1β (2) trattamento PEMF vs stimolazione Il-1β e trattamento PEMF (vedere la tabella supplementare S1).

Figura 1.

Impostazione sperimentale per il trattamento di campi elettromagnetici ad impulsi ad alta energia (PEMF / rPMS) di costrutti tendinei. (A) Le cellule progenitrici derivate da tendine derivato sono state isolate da ratti femmine F344 di 3 mesi (n = 3) e utilizzate per la generazione di costrutti simili a tendini 3D. Sono stati stabiliti quattro diversi gruppi di trattamento: un gruppo di controllo non trattato, un gruppo trattato + Il-1β, un gruppo di trattamento + PEMF e un gruppo di trattamento + PEMF + Il-1β. Dopo il trattamento con PEMF, l’RNA totale dei 4 gruppi di trattamento è stato isolato per l’analisi RNASeq. (B) Immagine di costrutti tendinei dopo 7 giorni di contrazione. (C) Posizione dei costrutti tendinei nella spirale PEMF durante il trattamento.

È importante sottolineare che né la stimolazione con Il-1β né l’esposizione a PEMF hanno ridotto la vitalità dei costrutti incorporati in 3D come evidenziato dalla colorazione Live / Dead (Figura 2A). Inoltre, l’esposizione al PEMF non ha avuto un impatto negativo sull’attività metabolica o sulla produzione di ATP dei TDSPC incorporati. Non sorprende che la stimolazione a 24 h con 10 ng / mL di Il-1β abbia moderatamente abbassato l’attività metabolica delle cellule, senza differenze evidenti dopo l’esposizione a PEMF (Figura 2B, C). Presi insieme, il trattamento PEMF e Il-1β dei costrutti 3D non ha suscitato un significativo effetto citotossico.

Figura 2.

Vitalità cellulare e attività metabolica cellulare dei costrutti simili a tendini trattati (A) Analisi vivo / morto che mostra cellule vitali in cellule verdi e morte in rosso. (B) Il contenuto totale di ATP cellulare dopo il trattamento con Il-1β e + PEMF + Il-1β è significativamente diminuito rispetto al trattamento non trattato o al solo trattamento con PEMF. (C) Il test MTT è stato eseguito per la determinazione dell’attività metabolica dei TDSPC, mostrando una significativa riduzione dell’attività metabolica nei gruppi di trattamento + Il-1β e + PEMF + Il-1β. ** p <0,01, *** p <0,001.

3.2. Risposte Globali in TDSPC Il-1β-Primed dopo PEMF Exposure L’esplorazione esplorativa della mappa di calore ha rivelato che l’esposizione di costrutti tendinei 3D trattati con Il-1β ha provocato un cambiamento nel pattern di espressione di circa 5400 geni (valore p <0,05; Figura 3 e integratori Tabella S1).

Figura 3.

Heatmap non controllata di geni differenzialmente espressi dimostra risposte globali di costrutti 3D dopo esposizione PEMF (cambiamento ≥2,5 volte, valore p <0,05). Al fine di caratterizzare ulteriormente i geni regolati in risposta al PEMF, l’analisi di ontologia genica (GO) è stata eseguita sulla base di geni identificati per essere regolati differenzialmente tra i 2 gruppi (cambiamento di piega [+ PEMF +/- Il-1β] vs. [+ / – Il1β]; Supplementary Table S1). I primi 20 termini GO classificati per il valore p corretto sono elencati nella Tabella 1. È interessante notare che, accanto a termini più generali (ad es. Risposta al farmaco, regolazione della proliferazione cellulare, ecc.), I geni differenzialmente espressi sono stati assegnati ai processi che guidano il negativo regolazione dell’apoptosi cellulare, organizzazione della matrice extracellulare e fibrillazione del collagene e guarigione delle ferite (vedere la Tabella S2 supplementare per i geni assegnati).

Tabella 1. Primi 20 termini GO assegnati a geni differenzialmente espressi in costrutti del tendine stimolati con Il-1β dopo esposizione a PEMF.

Sulla base dell’assegnazione ai vari processi biologici, è stata generata nuovamente una heatmap non riservata per tutti i geni che mostrano una differenza minima di espressione di 2 volte.

Come mostrato nella Figura 4A, B, per i geni associati al rimodellamento della matrice extracellulare e dell’organizzazione della fibrillazione del collagene erano evidenti solo differenze moderate. In confronto, 77 geni associati alla regolazione negativa dell’apoptosi hanno mostrato una risposta più robusta dopo l’esposizione a PEMF (Figura 5 e Tabella S3 supplementare).

Figura 4.

Heatmap riassumendo l’espressione differenziale dei geni associati (A) con i termini GO “organizzazione a matrice extracellulare” e geni (B) assegnati al termine GO “organizzazione del collagene fibrillare” (cambiamento ≥2,0; valore p <0,05).

Heatmap di geni differenzialmente espressi identificati per i 2 gruppi accoppiati ([- / + Il-1β] e [+ PEMF – / + Il-1β]) assegnati al termine GO “regolazione negativa del processo apoptotico” (≥2,0 fold change, pvalue <0.05). Infine, abbiamo determinato i geni comunemente differenzialmente espressi in risposta all’esposizione PEMF dopo il trattamento con Il-1β. In altre parole, abbiamo determinato in che modo l’esposizione PEMF modula la risposta dei costrutti del tendine 3D alla stimolazione di Il-1β. Come dimostrato dall’analisi del diagramma di Venn (Figura 6), solo un piccolo numero di geni ha mostrato una risposta superiore a 2 volte (valore p <0,05).

Figura 6.

Diagramma VENN quantitativo che mostra la sovrapposizione di geni derivati ​​dall’analisi di espressione differenziale. I geni comunemente regolati (cambiamento ≥2,0 volte) sono parzialmente mostrati nelle caselle. 3 di questi geni sono stati significativamente sovra-regolati, mentre 39 geni sono stati identificati per essere regolati verso il basso (i primi 5 mostrati). Tuttavia, molti dei geni identificati appartengono a proteine ​​della matrice extracellulare (es. Col9a3), sono coinvolti nell’infiammazione e / o citoprotezione (es. Il1r2, Csf3), o nella regolazione dell’apoptosi (Ltk), sottolineando ulteriormente i risultati della GO analisi (vedi Tabella 2). Tabella 2. Riassunto delle risposte dei geni comuni confrontando i costrutti del tendine 3D trattati con Il-1β da solo (+/- Il-1β) o esposti a PEMF con Il-1β (+ PEMF +/- Il-1β).

3.3. L’esposizione PEMF non altera la struttura o il turn over della matrice extracellulare in colture 3D Dato che l’incarico GO indica che i geni coinvolti nel rimodellamento ECM e anche nella fibrillogenesi del collagene sono stati influenzati, abbiamo esaminato se l’esposizione PEMF si traduce in un cambiamento strutturale del tendine 3D costrutti simili. Pertanto, sono stati generati costrutti generati da un totale di 4 ratti singoli, mentre l’allineamento e il confezionamento del collagene sono stati analizzati mediante microscopia di polarizzazione. L’orientamento globale e l’imballaggio della fibra di collagene non sono stati modificati in modo significativo in risposta al trattamento con Il-1β, al solo trattamento PEMF o in combinazione, come evidenziato dalle intensità del segnale di birifrangenza (Figura 7A, B). Inoltre, non abbiamo osservato alcun cambiamento significativo nell’angolazione nucleare e nella disposizione del citoscheletro dell’actina, indicando che non vi era alcun impatto significativo sull’allineamento cellulare nei costrutti trattati (Figura 7A, C). Successivamente abbiamo esaminato l’effetto dell’esposizione PEMF sui livelli di mRNA di diversi geni che codificano per proteine ​​e MMP dell’ECM mediante qRT-PCR. Come previsto, il trattamento delle colture TDSPC 3D-embedded con Il-1β ha comportato una diminuzione significativa nell’espressione del collagene di tipo I e di tipo III (Figura 7D). Sebbene l’esposizione al PEMF tendenziale abbia parzialmente recuperato l’espressione del collagene, nessuno dei risultati era statisticamente significativo, ad eccezione del collagene di tipo IX associato alla fibrilla, che conferma i risultati dell’analisi dell’espressione genica differenziale (vedi Tabella 2). La stimolazione di Il-1p ha ulteriormente migliorato significativamente l’espressione di diverse metalloproteasi della matrice, ma ancora una volta il trattamento con PEMF non ha alterato significativamente la loro espressione (Figura 7E) o l’attività di MMP2 o MMP9 come evidenziato dall’analisi densitometrica degli zimogrammi di gelatina (Figura 7F). Presi insieme, 2 cicli di 90 minuti di trattamento PEMF / rPMS (82mT, 125kHz) non suscitano eventuali cambiamenti strutturali acuti a breve termine dell’ECM, né attenuano significativamente l’induzione delle MMP. Il trattamento con Il-1β ha diminuito l’espressione di geni correlati al tendine come la scleraxis, la tenomodulina e il mohawk, l’esposizione al PEMF ha parzialmente ripristinato l’espressione di questi geni, sebbene questo non fosse statisticamente significativo (Figura 7G).

Figura 7.

Organizzazione della matrice extracellulare in costrutti tendinei prima e dopo il trattamento con Il-1β e / o PEMF. (A) Immagini microscopiche di polarizzazione, colorazione di phalloidin e colorazione nucleare (DAPI) di costrutti di tendine 3D. (B) Intensità di birifrangenza relativa come surrogato per l’organizzazione della fibra di collagene (n = 4). (C) Angolo di fibra da sforzo in actina e dispersione angolare nucleare determinato per i 4 gruppi di trattamento (n = 4). (D) L’espressione dei geni della matrice extracellulare Col1a1, Col1a2, Col3a1 e Col9a3 è rappresentata da un trattamento PEMF up-regulation in campioni stimolati pro-infiammatori (+ PEMF + Il-1β) sebbene non statisticamente significativo (n = 9). (E) In condizioni pro-infiammatorie la matrice metalloproteinasi-1, -2, -3, -9, -11 e -13 non mostrano cambiamenti significativi

nella loro espressione dopo il trattamento con PEMF (n = 7). (F) Attività relativa di MMP2 e MMP9 in costrutti stimolati con Il-1β con e senza esposizione a PEMF (n = 10). (G) Espressione dei geni marcatori tendinei correlati Scleraxis (Scx), Tenomodulina (Tnmd) e Mohawk (Mkx) viene ripristinata dopo il trattamento PEMF dei costrutti del tendine pro-infiammatorio innescato (n = 6).

3.4. Trattamento con PEMF Drives Espressione di citochine citoprotettive Poiché il trattamento con PEMF ha dimostrato di influenzare positivamente l’espressione e il rilascio di citochine anti-infiammatorie, abbiamo successivamente verificato l’espressione differenziale del Recettore del recettore 1β Il1r2 che è stato identificato come uno dei geni regolati dall’alto mediante analisi RNASeq. Inoltre, il cambiamento nell’espressione delle citochine di famiglia Il-6 / gp130 Il-6, fattore 3 stimolante le colonie (Csf3), fattore di inibizione della leucemia (Lif) e Il-11 è stato valutato da RT-qPCR. Come mostrato nella Figura 8A, l’espressione di Il1r2 è aumentata di circa 5 volte dopo aver esposto i costrutti Il-1β-primer a PEMF. Inoltre, Csf3, Il-6 e Lif hanno mostrato un moderato, ma statisticamente non significativo aumento nell’espressione di mRNA, mentre nessuna differenza era evidente per Il-11. A livello proteico, anche i livelli di IL-6 secreti erano elevati (circa il 50%), tuttavia le risposte dei singoli replicati biologici erano molto eterogenee. Tuttavia, in sintesi, questi risultati indicano che l’esposizione a PEMF provoca una risposta pleiotropica, antinfiammatoria in parte mediata dall’espressione di citochine citoprotettive e attenua l’azione proinfiammatoria di Il-1β elevando i livelli del recettore di decoy Il1r2.

Figura 8. Espressione di mRNA di citochine citoprotettive. (A) L’espressione genica di Il1r2 è stata significativamente up-regolata dopo il trattamento con PEMF, e alcuni membri di citochine potenzialmente citoprotettive della famiglia Il-6 / gp130 mostrano anche un aumento di tendenza (n = 9) (B) livelli di citochine Il-6 erano anche elevati nei costrutti sopramatati da colture PEMF come evidenziato dall’analisi ELISA (n = 5). (Fattore inibitore della leucemia vitale, fattore 3 stimolante le colonie Csf3). * p <0,05.

3.5. PEMF limita l’apoptosi indotta da Il-1β Poiché un numero significativo di geni differenzialmente regolati è stato assegnato al termine GO “regolazione negativa dell’apoptosi”, abbiamo esaminato se il trattamento con PEMF è effettivamente in grado di attenuare l’apoptosi Ιl-1β-mediata. L’innesco di TDSPC 3D-embedded con 10 ng / ml di Il1β ha comportato un aumento significativo delle cellule apoptotiche come determinato dalla rilevazione in situ del DNA frammentato (saggio TUNEL, Figura 9A, B). Il trattamento con PEMF ha ridotto significativamente il numero di cellule apoptotiche e l’effetto anti-apoptotico è stato ulteriormente sottolineato dalle attività basali delle caspasi 3 e 7 rispetto ai costrutti coltivati ​​in condizioni di coltura cellulare proinfiammatoria (Figura 9C). Poiché l’attivazione di Erk1 / 2 generalmente promuove la sopravvivenza cellulare, abbiamo successivamente esaminato i livelli di fosforilazione di Erk1 / 2 dopo l’esposizione a PEMF. In effetti, il trattamento con PEMF generalmente aumenta i livelli di pErk1 / 2, non solo in condizioni proinfiammatorie (Figura 9D). Infine, poiché l’ossido nitrico (NO) è noto per influenzare l’apoptosi, abbiamo determinato il contenuto di NO nei supernatanti della coltura cellulare. Come mostrato nella Figura 9E, i livelli di NO erano significativamente ridotti nei costrutti del tendine 3D trattati con PEMF dopo il priming di Il-1β. In conclusione, il trattamento con PEMF riduce significativamente l’apoptosi indotta da Il-1β nei TDSPC coltivati ​​in 3D.

Figura 9. Il trattamento PEMF attenua l’apoptosi nei costrutti simil-tendinei stimolati pro-infiammatori. (A) Il saggio TUNEL è stato eseguito per visualizzare i nuclei delle cellule apoptotiche (verdi) che mostrano il caratteristico fenotipo frammentato. (B) La percentuale dei nuclei delle cellule apoptotiche è stata determinata, dimostrando un effetto anti-apoptotico dell’esposizione PEMF dei costrutti 3D innescati da Il-1β. (C) L’attività dell’enzima Caspase3 / 7 è stata determinata in lisati proteici di costrutti tendinei di tutti i gruppi di trattamento, confermando che il trattamento PEMF diminuisce significativamente l’apoptosi in campioni stimolati pro-infiammatori. (D) Western blot rappresentativo e analisi densitometrica (n = 4) per phosphoERK1 / 2 e totalERK1 / 2 dimostrano

attivazione di ERK1 / 2 dopo esposizione PEMF. (E) La concentrazione totale di NO è significativamente ridotta nei surnatanti di colture cellulari di + PEMF + Il-1β e + PEMF trattati come costrutti simili (n = 5). * p <0,05, ** p <0,01.

4. Discussione Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare la risposta globale dei costrutti tendinei 3D all’esposizione PEMF in condizioni infiammatorie per ottenere una visione meccanicistica dei processi regolati dal trattamento PEMF, che è spesso usato come terapia fisica non invasiva per la tendinopatia. La tendinopatia è un disturbo multifattoriale che rappresenta un numero elevato di pazienti che consultano un medico generico o ortopedico [1]. Attualmente, i disturbi del tendine sono trattati con un approccio conservativo (ad es. Fisioterapia, terapia extracorporea con onde d’urto, farmaci antinfiammatori) o mediante intervento chirurgico, spesso con risultati insoddisfacenti. Sebbene lo sviluppo di nuove ed efficaci strategie di trattamento sia limitato dalla nostra comprensione incompleta dei processi cellulari e molecolari che portano alle tendinopatie, si ritiene che la terapia pulsata del campo elettromagnetico abbia effetti benefici sulle condizioni del tendine. La terapia con campo elettromagnetico pulsato (PEMF) è un trattamento non invasivo, non termico, applicato principalmente per promuovere la guarigione. La Food and Drug Administration statunitense ha approvato la terapia PEMF per il trattamento di fratture ossee non sindacali, dolore postoperatorio, edema e osteoartrite [30]. I meccanismi biofisici attraverso cui PEMF sollecita le risposte cellulari e molecolari sono complessi e rimangono in gran parte irrisolti. Si ipotizza che il meccanismo d’azione primario sia quello di facilitare la riduzione e la risoluzione dei processi infiammatori. Ad esempio, PEMF a bassa frequenza applicato per 8 h su cellule tendenzialmente interessate in un sistema di coltura 2D ha rivelato, accanto a una maggiore espressione di marcatori correlati al tendine, il rilascio potenziato di citochine anti-infiammatorie [31]. Gli studi pre-clinici su un modello di riparazione della cuffia dei rotatori di ratto hanno indicato che il trattamento con PEMF migliora la guarigione precoce del tendine e un concomitante aumento del modulo di Young e lo stress massimo per il cedimento del tessuto tendineo [32]. In un altro studio preclinico, la PEMF ha aumentato la resistenza a trazione del tendine d’Achille guarito dopo completa transezione in un modello di ratto [33]. Clinicamente, è stato dimostrato che la terapia PEMF ha effetti positivi sulle lacrime della cuffia dei rotatori che influenzano i parametri del dolore multiplo e migliora la gamma di movimento e la forza muscolare [34], indicando un effetto positivo sulla guarigione del tendine. Tuttavia, poiché i meccanismi causali cellulari e molecolari per l’azione della PEMF sulle cellule residenti tendinee sono insufficientemente compresi, abbiamo mirato a esplorare la risposta globale all’esposizione PEMF in costrutti simili a tendini 3D innescati da infiammazione eseguendo il sequenziamento dell’RNA. Il sequenziamento dell’RNA ha identificato 5400 geni per essere espressi in modo differenziale sull’esposizione PEMF sotto stimolazione Il-1β, di cui diversi sono noti per regolare l’apoptosi, l’organizzazione della matrice extracellulare o l’organizzazione della fibrillazione del collagene e i geni codificanti per le proteine ​​citoprotettive. I meccanismi patofisiologici della tendinopatia finora descritti includono apoptosi disregolata, sovraccarico meccanico, attivazione della matrice metalloproteinasi, predisposizione genetica e infiammazione. Negli anni passati sono cresciute le prove del ruolo dell’infiammazione nello sviluppo della tendinopatia, sebbene i protagonisti restino ancora pienamente caratterizzati. È noto che i livelli di interleuchina-1β sono aumentati nella tendinopatia e dopo la lesione del tendine. Numerosi studi hanno dimostrato che la stimolazione di Il-1β di cellule tendenzialmente interessate reprime l’espressione di collagene di tipo 1, aumenta l’espressione di metalloproteinasi della matrice [5,7,35,36] o porta ad effetti citotossici e attivazione della caspasi sia in colture cellulari 2D che 3D [37 , 38]. È stato inoltre dimostrato che Il-1β downregola in modo irreversibile l’espressione di produttori di tenogeni come la scleraxis o la tenomodulina e altera il metabolismo cellulare nelle cellule tendinee isolate dai tendini feriti [36].

Come evidenziato dall’analisi qPCR, nel nostro studio l’esposizione PEMF ha parzialmente ripristinato l’espressione dei geni del collagene e dei marcatori tenogenici Tnmd e Mkx dopo stimolazione pro-infiammatoria. Inoltre, a

è stato osservato un aumento significativo dell’espressione di MMP con la stimolazione di Il-1β, che è in accordo con i dati precedentemente pubblicati. Le principali metalloproteinasi della matrice che promuovono il danno e la degenerazione del tendine sono MMP1, MMP2, MMP3, MMP9 e MMP13, dove MMP1 e MMP13 sono prevalentemente coinvolti nella degradazione dei collageni di tipo 1, tipo 2 e tipo 3. Successivamente MMP2 e MMP9 degradano proteoliticamente questi collagene frammenti di entità minori. L’MMP3 è coinvolta nell’attivazione proteolitica di altre MMP e l’MMP3 insieme con MMP2 può promuovere il processo di guarigione. Un’aumentata attività MMP netta dovrebbe essere un indicatore di degradazione della matrice, che potrebbe essere una delle prime fasi del rimodellamento della matrice nella guarigione delle ferite [35]. Tuttavia, non abbiamo riscontrato un impatto significativo sull’espressione o sull’attivazione di MMP in seguito all’esposizione a PEMF. Ciò è anche in accordo con uno studio precedente di Ongaro A. et al., Che dimostra che la PEMF a bassa intensità non ha influenzato la

produzione di enzimi degradanti la matrice, ma ha avuto effetti antiinfiammatori nei fibroblasti sinoviali isolati da pazienti con osteoartrite [39].

La citochina pleiotropica Il-6 ha un ruolo centrale nell’infiammazione e nel danno tissutale ed è stato dimostrato di essere potenziato nelle cellule residenti nel tendine dopo il trattamento con Il-1β, inducendo la fase di risposta acuta e migliorando la fase di guarigione promuovendo l’espressione del collagene di tipo 1 [ 35]. È interessante notare che la terapia extracorporea ad onde d’urto (ESWT) applicata alle cellule tendinee ha aumentato l’espressione di Il-6 [40] e il ricombinante Il-6 è stato utilizzato come intervento terapeutico mediante infusione nel tessuto peritendinoso dei tendini di Achille umano, con conseguente aumento della sintesi del collagene [41] . Inoltre, Il-6 ha mostrato di avere un effetto inibitorio sull’espressione delle proteine ​​regolatrici del complemento, suggerendo che Il-6 può ridurre la sensibilità dei tenociti alla lisi cellulare mediata dal complemento [7]. Qui mostriamo che due esposizioni di 60 min PEMF / rPMS a 82mT hanno influenzato positivamente l’espressione e il rilascio Il-6 in costrutti di tipo tendineo stimolato infiammatorio. Inoltre, i geni che codificano per le proteine ​​citoprotettive Csf3 o Lif sono stati moderatamente migliorati dopo l’esposizione a PEMF. È interessante notare che il recettore Il1r2 del recettore Il-1β era significativamente più alto espresso dopo l’esposizione a PEMF, molto probabilmente attenuando l’azione pro-infiammatoria di Il-1β. Recentemente è stato dimostrato che Il1r2 svolge un ruolo centrale nella protezione dei tenociti derivati ​​da cellule staminali embrionali (ESC) dall’infiammazione mediata da Il-1β nelle colture tendinee 3D. McClellan et al. Dimostrare che Il-1β diminuisce la capacità dei tenociti fetali e adulti di formare costrutti maturi tendinei, mentre i costrutti derivati ​​da ESC sembravano normali. Poiché i tenociti derivati ​​dal CES hanno espresso alti livelli di Il1r2, la traslocazione di NF-KB nel nucleo dopo la stimolazione con Il-1β è stata significativamente ridotta, con possibile conferimento di citoprotezione [37]. L’ossido nitrico (NO) è una molecola chiave nella patogenesi dell’infiammazione e viene prodotto sulla lesione del tendine. Le synthases dell’ossido nitrico (NOS) sono sovraregolate in tendinopatia [5,42] che influiscono sull’espressione di diverse citochine e sulla sintesi del collagene. Nelle cellule del tessuto connettivo NO contribuisce all’apoptosi in condizioni infiammatorie e livelli elevati di NOS sono stati associati all’apoptosi nella tendinopatia di Achille [7]. Oltre all’aumento dei livelli di NO, è stata osservata anche un’elevata attività di caspasi-3 nei tendini equini infiammati e si ritiene che l’aumento della morte cellulare per apoptosi e una clearance ridotta delle cellule apoptotiche influenzi l’omeostasi del tendine e contribuisca alla degenerazione dei tendini. Inoltre, l’attivazione di Erk1 / 2 ha dimostrato di promuovere la sopravvivenza cellulare guidando i processi anti-apoptotici da un’ampia gamma di risposte che implicano o l’attivazione transitoria o prolungata, mentre l’inibizione di Erk1 / 2 è nota per avere un effetto pro-apoptotico [43]. Tuttavia, i meccanismi con cui l’attivazione di Erk1 / 2 controlla l’apoptosi sono complessi e variano a seconda del tipo di cellula o tessuto studiato. Erk1 / 2 può promuovere la sopravvivenza cellulare sopprimendo la funzione delle proteine ​​proapoptotiche e / o migliorando l’attività delle molecole anti-apoptotiche (ad esempio, regolazione dei fattori di trascrizione anti-apoptotica, up-regulation della traduzione delle proteine ​​antiapoptotiche) [44 ]. Complessivamente, sebbene le risposte di espressione genica globale fossero generalmente moderata, l’azione multimodale del trattamento con PEMF ha comportato una significativa riduzione dell’apoptosi nelle colture di tenociti di ratto incorporate in 3D. Presi insieme, i nostri risultati suggeriscono che il PEMF ad alta energia limita gli effetti catabolici di uno stimolo proinfiammatorio da parte di Il-1β inducendo l’espressione di molecole protettive cellulari e attenuando l’apoptosi, spostando così un ambiente degenerativo e infiammatorio verso uno stato riparativo più tissutale.

Materiali supplementari I seguenti sono disponibili online all’indirizzo https://www.mdpi.com/2073-4409/8/5/399/s1, tabella S1: dati RNASeq; Tabella S2: geni assegnati dal termine GO; Tabella S3: Elenco dei geni assegnati a GO: regolazione negativa dei processi apoptotici, rimodellamento ECM e organizzazione della fibrillazione del collagene; Tabella S4: Oligo e sequenze di sonde di TaqMan Assay utilizzate per l’analisi dell’espressione genica.

Contributi dell’autore Concettualizzazione, A.T., R.G. e S.K .; Metodologia, B.S., R.G., M.J., S.K., A.W., C.L., N.W. e H.T .; Analisi formale, B.S., R.G., H.T. e A.T .; Scrittura: preparazione al draft originale, R.G. e A.T .; Revisione e modifica, A.T., R.G. e H.T .; Supervisione, A.T. e R.G.

Finanziamento Questo studio è stato in parte finanziato da Healthfactories GmbH.

Riconoscimenti Ringraziamo Healthfactories GmbH per aver fornito il dispositivo promesso © OMNITRON per la durata dello studio.

Conflitti di interesse A.T. detiene azioni di Healthfactories GmbH. Tutti gli altri autori dichiarano alcun conflitto di interessi. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella scrittura del manoscritto, o nella decisione di pubblicare i risultati.

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